pcrmix：反應(yīng)條件：pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定結(jié)果如圖3所示，從圖3中可以看出，6、8、9號(hào)為pirb基因敲入小鼠在、，wt小鼠pcr產(chǎn)物沒有這兩個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物。(c)短鏈pcr反應(yīng)，引物如下：primers(℃):forwardprimer(f4):5’-aacaatcaggctgccgaatctg-3’reverseprimer(r4):5’-ctttattagccagaagtcagatgc-3’expectedpcrproduct:targetedallele:344bppirb基因敲入型小鼠能夠擴(kuò)增出344bp的產(chǎn)物，而野生型沒有。pcr體系：反應(yīng)條件：(2)f1代小鼠測(cè)序：通過pcr擴(kuò)增后測(cè)序鑒定小鼠基因型，如圖4所示，為6號(hào)pirb基因敲入小鼠測(cè)序峰圖，pcr所用引物如下：sequencingprimerforpcrproduct1：5’sequenceprimer(f3):5’-cacttgctctcccaaagtcgctc-3’sequencingprimerforpcrproduct2:3’sequenceprimer(r3):5’-atactccgaggcggatcacaa-3’(3)southern雜交檢測(cè)f1代小鼠基因型：采用bamhi和avrii核酸內(nèi)切酶切割dna分子，切割示意圖如圖5。具體的southern雜交檢測(cè)過程如下：步驟a、提取f1代小鼠尾部dna；步驟b、制備探針，通過pcr方法將dig-dutp滲入到步驟a的dna分子中。開展小鼠疾病模型初步研究分析小鼠疾病模型研究初步結(jié)果與生物學(xué)信息資料等相關(guān)知識(shí)間的差距！徐州生殖疾病動(dòng)物模型建模

可以嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)材料的可比性一般說來，臨床上很多疾病是十分復(fù)雜的，各種因素均起作用，患有心臟病的病人，可能同時(shí)又患有肺臟疾病或腎臟疾病等其他疾病，即使疾病完全相同的病人，因病人的年齡、性別、體質(zhì)、遺傳等各不相同，對(duì)疾病的發(fā)性發(fā)展均有影響。采用動(dòng)物來復(fù)制疾病模型，可以選擇相同品種、品系、性別、年齡、體重、活動(dòng)性、健康狀態(tài)、甚至遺傳和微生物等方面嚴(yán)加控制的各種等級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用單一的病因作用復(fù)制成各種疾病。溫度、濕度、光照、噪音、飼料等實(shí)驗(yàn)條件也可以嚴(yán)格控制。南通酒精肝疾病動(dòng)物模型建模便于研究者按實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枰S時(shí)采取各種樣品。

pirb的功能和下游抑制性信號(hào)通路仍然未被闡明，因此迫切需要pirb的細(xì)胞和動(dòng)物模型。目前對(duì)于pirb基因功能的研究，多采用可溶性的pirb的胞外段(pirbextracellularpeptide，pep)和抑制劑，或者采用慢病毒轉(zhuǎn)染。前者受到是否能夠透過血腦屏障和抑制劑效率的影響，后者慢病毒轉(zhuǎn)染在原代細(xì)胞和在體的轉(zhuǎn)染效率比較低，使研究pirb的功能受到極大的限制。為解決這些問題，我們通過crispr/cas9技術(shù)建立了pirb基因敲入小鼠，將pirb基因敲入c57bl/6j的rosa26位點(diǎn)，為研究pirb在免疫系統(tǒng)或者神經(jīng)系統(tǒng)的作用和機(jī)制提供了很好的工具。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供pirb基因敲入的小鼠動(dòng)物模型。

無縫克隆的原理：在載體末端和引物末端應(yīng)具有15-25個(gè)同源堿基（同源臂）。通過T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶，三種酶同時(shí)發(fā)揮功能，從而達(dá)到單片段或多片段與載體連接的技術(shù)。T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，形成粘性末端；DNA聚合酶：填補(bǔ)缺口；DNA連接酶：兩條DNA單鏈黏合起來。無縫克隆的特點(diǎn)傳統(tǒng)分子克隆無縫克隆傳統(tǒng)分子克隆和無縫克隆對(duì)比：?jiǎn)未尾迦肫危簜鹘y(tǒng)分子克隆一輪只能插入一個(gè)片段；無縫克隆單個(gè)至多個(gè)（≤5）。受限于酶切位點(diǎn)：傳統(tǒng)分子克隆是；無縫克隆不是。引入多余序列：傳統(tǒng)分子克隆是；無縫克隆不是。流程&操作時(shí)間：傳統(tǒng)分子克隆流程繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)。無縫克隆流程簡(jiǎn)單，時(shí)間短?？寺⌒剩簜鹘y(tǒng)分子克隆較低；無縫克隆單片段≥95%。實(shí)驗(yàn)流程1.載體制備載體的線性化：酶切（單酶切、雙酶切）或反向PCR擴(kuò)增。①酶切制備使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行載體線性化時(shí)，推薦使用雙酶切方法進(jìn)行，其次是單酶切。注意:1：經(jīng)雙酶切進(jìn)行線性化的載體無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化；2：酶切完成后，應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)⒛康漠a(chǎn)物進(jìn)行純化后再用于重組反應(yīng)。②反向PCR擴(kuò)增制備載體末端引物設(shè)計(jì)：反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體需要使用的引物。很多自發(fā)性動(dòng)物模型在研究人類疾病時(shí)具有重要的價(jià)值。

2mg組、4mg組、6mg組lh水平均上升，同樣，只有2mg組有明顯升高(p＜)，如圖3所示。表3表4②體重變化：(mean±sd)，如圖4所示：2mg組(連續(xù)注射7天)與空白組相比，大鼠體重***下降(p＜，注射第2天開始)。3mg組(連續(xù)注射7天)與空白組相比，大鼠體重***下降(p＜，注射第4天開始)，直至第12天*存活1只大鼠。4mg、6mg組(第1、8天注射)與空白組相比，大鼠體重分別在***次及第二次注射后的有***下降(p＜)，4mg組體重在停止給藥后4天與空白組無差異。③卵巢重量：如表5、圖5所示，2mg、6mg組大鼠在經(jīng)過順鉑注射后卵巢重量相比對(duì)照組，都有不同程度縮減，其中2mg組卵巢重量明顯減輕(p＜)，4mg、6mg組無明顯差異。表5④動(dòng)情周期觀察(陰道涂片)：3mg組動(dòng)物死亡時(shí)間早，無完整的動(dòng)情周期。如表、圖6所示。正常大鼠動(dòng)情周期4-5天。分為四個(gè)階段，動(dòng)情前期：撇圓形有核上皮細(xì)胞占絕大多數(shù)，白細(xì)胞和角化上皮細(xì)胞很少(圖a)。動(dòng)情期：角化上皮細(xì)胞占多大多數(shù)，由散在增至集白細(xì)胞和有核上皮細(xì)胞很少(圖b)。動(dòng)情后期：片狀角化上皮細(xì)胞，有核上皮細(xì)胞和白細(xì)胞3種都有，無太大差異(圖c)。動(dòng)情間期：白細(xì)胞占絕大多數(shù)，有核上皮細(xì)胞和角化上皮細(xì)胞很少(圖d)?？梢試?yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)材料的可比性。徐州生殖疾病動(dòng)物模型建模

查閱已有的相關(guān)小鼠模型綜述文獻(xiàn)。徐州生殖疾病動(dòng)物模型建模

f1代小鼠southern印記的5’探針引物如下：primersfor5’probe:5’probeforwardprimer:5’-aaacgtggagtaggcaatacccagg-3’5’probereverseprimer:5’-aaagaagggtcacctcagtctccct-3’primersfor3’probe:3’probeforwardprimer:5’-ttctgggcaggcttaaaggctaac-3’3’probereverseprimer:5’-aggagcgggagaaatggatatgaag-3’southern印記的目標(biāo)片段大小如下：5’probe-bamhi:3’probe-avrii:。步驟c、采用限制性內(nèi)切酶bamhi和avrii對(duì)dna進(jìn)行切割；瓊脂糖凝膠電泳分離dna；步驟d、將dna轉(zhuǎn)到尼龍膜上；步驟e、探針變性后，與dna分子進(jìn)行雜交，nbt/bcip化學(xué)顯色法顯色，拍照觀察。southern雜交結(jié)果如圖6所示，可以看到：6、8、9號(hào)pirb基因敲除小鼠如果被bamhi切割，在，wt小鼠只在，如果被avrii切割，pirb基因敲除小鼠在，wt小鼠只在。步驟6、將f1代雜合子小鼠近交獲得f2代純合子pirb基因敲入小鼠，即為本發(fā)明所述小鼠pirb基因敲入的動(dòng)物模型。將本發(fā)明獲得的動(dòng)物模型f2代純合子小鼠與同品系小鼠組織/細(xì)胞特異性cre表達(dá)的小鼠雜交，獲得f3代小鼠，可以實(shí)現(xiàn)在不同組織或者細(xì)胞類型中敲入pirb基因。對(duì)f3代小鼠進(jìn)行基因型的鑒定：含有無(pirb-cwt)、一個(gè)(pirb-chet)或者兩個(gè)。徐州生殖疾病動(dòng)物模型建模